PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

v

SUMMARY
Graduating thesis: " Isolating PRRS virus by MARC-145 cell and confirming the
virus by RT-PCR technology". The thesis have been done from March to August,
2007 at Microbiology And Infectious Diseases Dept. of Faculty Of Animal Science
Veterinary and Center For Chemical And Biological Analysis And Experiment of
Nong Lam university Hồ Chí Minh city.
Purpose of this reseach: Isolate PRRS virus from different specimens and
determine its appearance by RT-PCR technology. The contain is concerned about:
 Reviewing the cell and determine how long once transfer, length of time for
cells grows to make monolayer, in flash with the amount of 7.10
5
and 10
6
.
 Observating MARC-145 cell`s pathology after infecting the cells with
different specimens such as: serum, lung, lympho nodes.
 Determine virus` appearance from MARC-145 cell's pathology after days
postinfection by RT-PCR technology (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain
Reaction).
Finally, we have results:
o The average period of one transfer with the amount of 7.10
5
cells is 72,565
hours, 10
6
cells is 46 hours.


o MARC-145 after reviewing from liquid nitrogen grow normally.
o Isolating PRRS virus from lung, lympho nodes, serum in MARC-145 cell
invironment. 3 specimens have MARC-145 cell's pathology postinfection: 2
lymphonotes, 1 lung (3/11 specimens).
o We detect the positive form of PRRS RNA by RT-PCR: lympho node.






vi

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN iii
TÓM TẮT iv
SUMMARY v
MỤC LỤC vi
DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ ix
DANH SÁCH CÁC HÌNH x
DANH SÁCH CÁC BẢNG xi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT xii
Chƣơng 1: MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích - Yêu cầu 2
Chƣơng 2: TỔNG QUAN 3
2.1. Tổng quan về nuôi cấy tế bào 3
2.1.1. Một số đặc điểm của tế bào động vật 3
2.1.2. Thành phần cơ bản của môi trƣờng nuôi cấy 4
2.1.3. Điều kiện nuôi cấy 6
2.1.4. Sự tạp nhiễm và cách hạn chế 6
2.2. Phƣơng pháp PCR 6
2.2.1. Nguyên tắc 7
2.2.2. Thực nghiệm 7
2.2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng PCR 8
2.2.4. Phƣơng pháp RT-PCR 9
2.3. Sơ lƣợc về căn bệnh, bệnh do virus 10
2.3.1. Lịch sử bệnh 10
2.3.2. Căn bệnh học 11
2.3.2.1. Phân loại 11
2.3.2.2. Một số đặc điểm về hình thái và cấu trúc 12

vii
2.3.2.3. Đặc điểm nuôi cấy 14
2.3.2.4. Sức đề kháng 16
2.3.3. Dịch tễ học bệnh PRRS 16
2.3.3.1. Loài mắc bệnh 16
2.3.3.2. Phƣơng thức lây lan 16
2.3.3.3. Đƣờng xâm nhập 17
2.3.3.4. Cơ chế sinh bệnh 17
2.3.4. Triệu chứng lâm sàng 20
2.3.5. Chẩn đoán 20
2.3.5.1. Chẩn đoán lâm sàng 20
2.3.5.2. Chẩn đoán phi lâm sàng 21
2.3.5.2.1. Phƣơng pháp phát hiện kháng thể 21
2.3.5.2.2. Các phƣơng pháp phát hiện kháng nguyên 22
2.3.5.2.3. Phát hiện gen của virus PRRS 23
2.3.5.2.4. Phân lập virus trên môi trƣờng tế bào 23
Chƣơng 3: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 25
3.1. Thời gian và địa điểm 25
3.2. Đối tƣợng và số lƣợng mẫu 25
3.3. Nội dung nghiên cứu 25
3.4. Vật liệu và dụng cụ 26
3.4.1. Thiết bị và dụng cụ dùng cho nuôi cấy tế bào và phân lập virus 26
3.4.2. Vật liệu dùng cho nuôi cấy tế bào MARC-145 26
3.4.3. Thiết bị và dụng cụ dùng cho phản ứng PCR 27
3.4.4. Vật liệu và hoá chất cho chiết tách RNA 27
3.4.5. Vật liệu và hoá chất sử dụng cho RT-PCR 27
3.4.6. vật liệu và hoá chất cho điện di sản phẩm RT-PCR 28
3.5. Phƣơng pháp tiến hành 28
3.5.1. Phƣơng pháp lấy mẫu 28
3.5.2. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào MARC-145 28

viii
3.5.2.1. Hồi phục tế bào 28
3.5.2.2. Cấy chuyển tế bào 29
3.5.3. Phƣơng pháp phân lập virus 30
Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34
4.1. Thời gian một lần cấy chuyển tế bào MARC-145 34
4.2. Kết quả gây nhiễm lần một trên môi trƣờng tế bào MARC-145 35
4.3. Kết quả gây nhiễm lần hai trên môi trƣờng tế bào MARC-145 37
4.4. Kết quả RT-PCR 40
Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44
5.1. Kết luận 44
5.2. Tồn tại 44
5.3. Đề nghị 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO 45
PHỤ LỤC























ix

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ cơ chế sinh bệnh của virus PRRS 19
Sơ đồ 3.1. Sơ đồ phân lập và xác định virus PRRS 31
Sơ đồ 3.2. Sơ đồ thực hiện phản ứng RT-PCR 33





































x

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1. Virus PRRS 12
Hình 2.2. Đại thực bào bình thƣờng 15
Hình 2.3. Đại thực bào bị nhiễm virus PRRS 15
Hình 2.4. Triệu chứng bệnh tai xanh 20
Hình 2.5. Sảy thai do virus PRRS 20
Hình 3.1. Buồng đếm Neubauer 30
Hình 4.1. Đối chứng âm 40
Hình 4.2. Mẫu không có bệnh tích tế bào 40
Hình 4.3. Đối chứng dƣơng 40
Hình 4.4. Bệnh tích tế bào vào ngày thứ 7 sau gây nhiễm ở mẫu HP 41
Hình 4.5. Bệnh tích tế bào vào ngày thứ 7 sau gây nhiễm ở mẫu P2 41
Hình 4.6. Kết quả RT-PCR mẫu ly trích từ dịch nuôi cấy tế bào 42























xi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 4.1. Thời gian một lần cấy chuyển tế bào MARC-145 34
Bảng 4.2. Kết quả gây nhiễm lần một trên môi trƣờng tế bào MARC-145 36
Bảng 4.3. Kết quả gây nhiễm lần hai trên môi trƣờng tế bào MARC-145 38
Bảng 4.4. Kết quả RT-PCR từ mẫu dịch tế bào sau gây nhiễm 46


































xii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AMV: Avian Myeloblastosis Virus
cDNA: Complement Deoxynucleotide Acid
DEPC: Diethyl Pyrocarbonate
DNA: Deoxynucleotide Acid
dNTP: Deoxynucleotide Triphosphate
EDTA: Ethylene Diamine Tetra Acetate
ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay
EMEM: Eagle Minimum Essential Medium
FA: Florescent Antibody Staining
HRPO: Horseradish Peroxidase
IFA: Immuno Peroxidase Monolayer Assay
IHC: Immunohistochemistry Staining
IPMA: Immuno peroxidase Monolayer Assay
LAH: Lactalbumin Hydrolysate
MSD: Mystery Swine Disease
Nu: Nucleotide
ORF: Open Reading Frame
PAM: Porcine Alveolar Macrophage
PBS: Phosphate Buffer Saline
PBSA: Phosphate Buffer Saline Solution A
PCR: Polymerase Chain Reaction
PRRS: Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome
RNA: Ribonucleotide Acid
RT-PCR: Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
SN: Serum Neutralization
TBE: tris Borate EDTA
µl: Microlit


1
Chƣơng 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Từ nhiều năm nay, ngành chăn nuôi chiếm một vai trò quan trọng trong nền
kinh tế ở nƣớc ta vì nƣớc ta là một nƣớc nông nghiệp. Nó đã cung cấp một phần nhu
cầu thực phẩm thiết yếu của cuộc sống con ngƣời. Trong đó ngành chăn nuôi heo
không ngừng phát triển để cung cấp đủ số lƣợng cũng nhƣ chất lƣợng cho ngƣời
tiêu dùng. Do nhu cầu xã hội phát triển nên số lƣợng heo nuôi ngày càng tăng cao.
Song song với quá trình phát triển của ngành chăn nuôi heo thì giới chăn nuôi cũng
phải đối mặt với không ít khó khăn, đặc biệt là những bệnh ảnh hƣởng trực tiếp đến
thành tích sinh sản và tăng trƣởng của heo nhƣ: bệnh FMD, bệnh dịch tả heo, bệnh
đóng dấu son, bệnh giả dại…và gần đây nhất là một vấn đề đang làm đau đầu giới
chăn nuôi, nó ảnh hƣởng không nhỏ đến hiệu quả kinh tế của ngành chăn nuôi là hội
chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRS: porcine reproductive and
respiratory syndrome).
Bệnh do virus PRRS tiến triển phức tạp, khó khống chế lại ít biểu hiện triệu
chứng, tỷ lệ mắc bệnh cao, bệnh xảy ra ở mọi lứa tuổi. Bệnh gây sảy thai ở thời kỳ
cuối, chậm động dục, gia tăng số thai chết và heo con sơ sinh yếu, heo con chết
trƣớc khi sinh, còi cọc, chậm lớn. Những nghiên cứu về PRRS trƣớc đây chỉ dừng lại
ở việc điều tra tỷ lệ nhiễm bằng phản ứng ELISA để phát hiện kháng thể kháng virus
PRRS. Mặc dù việc nuôi cấy phân lập virus trên môi trƣờng tế bào khó, tuy nhiên
xác định sự hiện diện của virus từ mẫu huyết thanh dƣơng tính và các mẫu lâm sàng
là rất cần thiết để làm cơ sở cho công tác phòng bệnh và các nghiên cứu sau này.


2
Xuất phát từ thực tế trên, đƣợc sự phân công của Bộ Môn Công Nghệ Sinh
Học Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. HCM, dƣới sự hƣớng dẫn tận tình của ThS.
Trần Thị Bích Liên và BSTY Hoàng Thanh Hải, chúng tôi tiến hành thực hiện đề
tài: “Phân lập virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MARC- 145 và xác định
virus bằng kỹ thuật RT- PCR”.
1.2. Mục đích – Yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Xác định sự hiện diện của virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MARC- 145 bằng kỹ
thuật RT- PCR góp phần hoàn thiện dần quá trình chẩn đoán bệnh PRRS trên heo
và lấy đó làm cơ sở cho những nghiên cứu sau này.
1.2.2. Yêu cầu
Khảo sát đặc tính của tế bào MARC-145 bằng cách hồi phục tế bào và xác
định thời gian một lần cấy chuyển.
Phân lập virus PRRS từ huyết thanh, phổi, hạch phổi của heo nghi ngờ bệnh
trên môi trƣờng tế bào MARC-145.
Ghi nhận bệnh tích tế bào sau 7 ngày nuôi cấy.
Dùng kỹ thuật RT- PCR (Reverse Trascriptase - Polymerase Chain Reaction)
để xác định sự hiện diện của virus PRRS từ dịch tế bào nuôi cấy.

Xem chi tiết: PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR